1：RIP試驗(yàn)需要注意什么?
(1)防止RNA與蛋白非特異性結(jié)合。(2)避免RNA蛋白質(zhì)結(jié)合被破壞。
(3)避免外源RNAse污染。(4)抑制內(nèi)源RNase的活性。
(5)選擇適合做RIP的抗體。(6)避免RNA結(jié)合蛋白的降解。
2：為什么抗體無(wú)法沉淀RIP裂解液中的目標(biāo)蛋白?
(1)行IP或者WB，測(cè)試抗體可以與目標(biāo)RBP結(jié)合。
(2)另選一個(gè)能與抗原其他表位結(jié)合的抗體。
(3)盡可能選用密理博RIPAb+抗體。
(4)稀釋抗體成濃度梯度，進(jìn)行IP測(cè)試。
(5)4℃過(guò)夜孵育抗體與RIP裂解液。
(6)確定抗體類(lèi)型與Protein A/Protein G匹配。
3：提取RNA時(shí)，蛋白酶k消化不*是什么原因?
當(dāng)進(jìn)行蛋白酶K消化時(shí)，確保水浴溫度應(yīng)設(shè)置在55℃左右，在65℃以上孵育會(huì)導(dǎo)致蛋白酶K失活。
4：提取RNA后，A260/A280比值偏離1.8~2.2區(qū)域是什么原因?
(1)需要縮短酚氯仿提取RNA的時(shí)間間隔。
(2)測(cè)試提純后RNA中是否存在RNA酶，可能RNA發(fā)生了降解。
5：做RIP的時(shí)候和beads孵育的lysate的濃度如何確定?有些動(dòng)物的文獻(xiàn)提到用細(xì)胞板數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)，想知道如果用蛋白濃度的話，大概在什么數(shù)量范圍的蛋白總量對(duì)應(yīng)50 ul BEADS?
50 ul beads對(duì)應(yīng)的是一個(gè)reaction，而我們推薦一個(gè)reaction是100ul裂解上清(2×107 cells加入100ul RIP lysis buffer得到)，所以只需要在裂解前計(jì)數(shù)一下，并按括號(hào)中的比例加入裂解buffer，后續(xù)100 ul裂解上清就是一個(gè)reaction的蛋白用量。不建議通過(guò)裂解后測(cè)蛋白濃度的方法進(jìn)行配比。
6：RIP可以分提核漿的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物嗎?
理論上，可以采用能分別抽提核漿蛋白的蛋白抽提kit先分離樣本，再進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)。但需要特別注意的是所用kit中的reagent不能有RNase和DNase，以及要能與下游的抗體beads孵育兼容。
7：因?yàn)镽IP做完得到的是RNA序列，要做后續(xù)檢測(cè)，比如測(cè)序、判斷目標(biāo)序列位置等，是不是都必須要做RT-PCR，得到逆轉(zhuǎn)錄的DNA后，后面就跟ChIP相同了?
常見(jiàn)的用real time qRT-PCR。如果對(duì)照的目的是保證兩個(gè)樣品間加入的細(xì)胞量一致或者進(jìn)行定量，理論上說(shuō)，使用input作為判別，計(jì)算不同樣品上樣量的差異。如果對(duì)照的目的是為了看IgG以及目的抗體富集的非特異性mRNA的量的話，那么可以找一個(gè)確定不會(huì)與目的抗體結(jié)合的RNA片段設(shè)計(jì)primer進(jìn)行qPCR，用來(lái)看IgG以及目的抗體拉下來(lái)的背景情況。RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)的類(lèi)似應(yīng)用，但由于研究對(duì)象是RNA-蛋白復(fù)合物而不是DNA-蛋白復(fù)合物，RIP實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化條件與ChIP實(shí)驗(yàn)不太相同(如復(fù)合物不需要固定，RIP反應(yīng)體系中的試劑和抗體不能含有RNA酶，抗體需經(jīng)RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等等)。
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